在现代生命科学中，蛋白质一级结构——即其氨基酸序列——早已不再被视为静态的分子代码。它不仅决定蛋白质的空间构象和功能特性，更深刻影响细胞行为、信号通路动态、甚至进化路径与疾病机制。由此，获取蛋白质准确序列，成为深入理解其生物学功能与作用机制的起点。
不同于传统“蛋白鉴定”中的“归类识别”，蛋白测序（Protein Sequencing）关注的是完整而连续的氨基酸信息，用于解析未知蛋白、识别序列突变、确认药物蛋白一致性或追踪翻译后修饰等关键科研任务。在生物药开发、个体化医学、结构生物学、抗体工程等高精度领域，蛋白测序技术的精细化能力日益成为研究和应用决策的关键技术杠杆。
一、蛋白测序 ≠ 蛋白鉴定
在蛋白质组学研究中，“测序”“鉴定”等术语常被交替使用，导致术语误用、技术选择失误甚至研究假设混淆。
从定义上讲，蛋白测序是指对蛋白质进行氨基酸序列解析的过程，旨在重建其一级结构的连续排列，通常以N端到C端的方向表示全部或部分氨基酸序列。其目标是获取“序列本体”，而非仅判断蛋白的“存在性”或“类别归属”。
相比之下：
蛋白鉴定（Protein Identification）：依赖质谱-数据库匹配，确定某一肽段是否“属于”某已知蛋白。它是分类式的“归属判断”，而非逐位点的信息重建。
二、蛋白测序技术的演化
1、Edman 降解：高精度线性识别的开端
Edman 降解由 Pehr Edman 于20世纪50年代建立，是蛋白质序列解析的首次化学实现。该方法基于苯异硫氰酸（PITC）对N端氨基酸的专一性反应，通过顺序性标记与切除，在每一轮循环中释放并鉴定一个PTH-氨基酸，进而实现线性序列重建。
图1. Edman降解法示意图
Edman法的突出优点是：单个氨基酸级别的识别精度极高，误差可控，但缺点也很明显：
● 仅适用于具有游离N端的纯化样品；
● 序列长度受限，通常不超过30-50残基；
● 无法处理混合物或修饰蛋白。
尽管如此，它在现代蛋白药物与合成肽验证中仍具独特优势，如合成肽质量验证、重组蛋白N端信号肽切除效率评估、以及生物制品结构一致性评估等。
2、Bottom-up 质谱策略：高通量测序的技术中枢
质谱技术的引入，是蛋白测序发展中的关键转折点。Bottom-up 策略将蛋白质通过特异性蛋白酶（如胰蛋白酶）酶解为短肽段，通过LC-MS/MS对肽段进行碎裂与检测，再借助数据库比对或de novo算法重建蛋白质序列。
Kellie, J. F. et al. Mol Biosyst. 2010.
图2. 自下而上和自上而下策略对比示意图
该策略具备良好的通量、覆盖度与适配性，已成为目前最广泛应用的蛋白测序方法。然而，Bottom-up 本质上是一种间接的序列推导方式，其测序能力存在以下结构性限制：
● 序列上下文信息缺失，影响跨肽段修饰重建；
● 修饰定位依赖碎片完整性，存在识别歧义；
● 对于高度异构蛋白、融合蛋白或非模式生物蛋白，de novo测序仍面临准确率瓶颈。
尽管如此，Bottom-up 的策略在蛋白组学、抗体序列初筛、生物药残留分析等场景中仍是不可替代的核心工具。
3、Top-down 质谱策略：整分子结构识别的深入拓展
Top-down 测序策略跳过酶解步骤，直接将完整蛋白质送入高分辨率质谱系统，通过高能碎裂（如ETD、HCD、EThcD）解析其多级碎片离子，实现对一级结构的整分子解析。
Kellie, J. F. et al. Mol Biosyst. 2010.
图3. 自上而下策略原理示意图
该方法可在不破坏蛋白天然修饰组合的前提下，提供精确的序列与修饰定位信息，特别适用于：
● 蛋白质翻译后修饰（PTM）识别；
● 等电点异构体区分；
● 生物药质量属性评估。
Top-down 的主要技术挑战包括：
● 高分子量蛋白碎片图谱解析难度大；
● 对质谱平台分辨率、离子累积能力要求极高；
● 样本纯度、稳定性需严格控制。
尽管其在通量和样品适应性方面不及 Bottom-up，Top-down 在某些研究方向却不可替代，尤其是在需要保证结构连续性、修饰组合保真性、异构体清晰分离的情境下。例如抗体CDR区的微突变识别、PTM互作网络的建立、以及某些生物药的结构一致性备案等。
4、单分子蛋白测序的兴起
传统质谱测序策略均建立在肽段碎裂与谱图反演重建的逻辑基础之上。这种方法虽然成熟、通量高、适应性强，但其依赖片段信息进行反推的过程，天然存在分辨歧义、修饰丢失和链内关联缺失等局限性。近年来，研究者开始尝试发展无需酶解、无需拼接、可直接读取氨基酸顺序的单分子测序（Single-Molecule Protein Sequencing, SMPS）技术。这类技术的核心理念是：在不破坏蛋白整体结构的前提下，实现对单个分子的逐残基识别。
Restrepo-Pérez, L. et al. Nature Nanotech. 2018.
图4. 单分子蛋白测序基本流程与主要技术路径
（1）纳米孔测序（Nanopore-Based Sequencing）
纳米孔测序策略依托于生物或固态孔道的亚纳米级空间分辨能力，将蛋白质或短肽分子引导通过孔道通道，在此过程中监测穿孔分子的阻抗变化（ionic current blockade）。不同氨基酸残基的体积、电荷与疏水性等性质影响其在孔道中的空间占据与局部电流扰动，从而产生特征信号。
● 代表平台：Oxford Nanopore；
● 技术优势：理论上可在不拆分蛋白结构的条件下获取线性序列信息；
（2）荧光法测序（Fluorescence-Based Sequencing）
荧光测序方法通过对特定氨基酸类型引入可识别的荧光标记团，并将肽链固定于表面载体。随后，采用顺序化学处理或酶促降解逐步移除残基，同时利用高灵敏度多通道荧光成像系统记录每个周期所释放信号的光谱特征，从而推导残基顺序。
● 代表平台：Quantum-Si、Alamar Biosciences；
● 技术优势：理论上可应用于复杂背景中的微量样本，支持特定氨基酸的高特异性识别；
蛋白测序缺乏模板依赖、具有天然异质性、并常伴随多重翻译后修饰，其测序结果通常不具有唯一性，而是建立在实验策略、物理分辨率与数据模型之间动态权衡的基础上。本文梳理的几类测序技术路径，从化学降解到质谱分析，再到单分子水平的直接读取，实质上构成了一套彼此补偿的信息获取体系。这些方法并非相互替代，而是在面对不同研究目标与样本约束条件下，为实现结构精确性、序列覆盖率与修饰还原度之间的平衡提供了策略支持。
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